PCR, eller polymerasekjedereaksjon, er en sofistikert laboratorieteknikk som er mye brukt innen medisin og andre vitenskapelige felt. PCR-diagnostikk ble på en gang et virkelig gjennombrudd innen vitenskapen.
Description
Kvantitativ PCR er en type sanntids-PCR.
Dette forstås som en variant av PCR, hvor kinetikken til reaksjonen hele tiden registreres, noe som gjør det mulig å kvalitativt vurdere innholdet av spesifikke DNA-nukleotidsekvenser i en kompleks molekylblanding.
Kvantitativ PCR-metode vil bli diskutert mer detaljert nedenfor.
essensen av analysen
Kulturelle og serologiske metoder brukes spesielt ofte for å diagnostisere infeksjoner. Under den første bestemmes antistoffer mot et smittsomt patogen i blodserumet. I den andre brukes biologisk materiale tatt fra en syk person til å så et spesifikt medium som er gunstig for veksten av patogenkolonier. Diagnostikk i beggesak kan vare i dager eller uker.
PCR-undersøkelse kan utføres med ulike biologiske materialer som hentes fra en syk person. Blod og andre patologiske, fysiologiske og biologiske medier og væsker fungerer som prøver. Du kan gjøre PCR-avføring eller urin.
Atypiske og virale infeksjoner diagnostiseres oftest ved kvantitativ PCR, siden de kanskje ikke er enkle å diagnostisere på grunn av den spesifikke karakteren til den patologiske prosessen de provoserer frem. For å bestemme slike infeksjoner tar det tid, hvor antistoffer begynner å bli produsert i kroppen, bestemt av serologiske metoder. Men dette er uakseptabelt i noen tilfeller.
Utføringsmåte
PCR-metode - laboratoriepåvisning av infeksjon i prøver isolert fra pasienten (in vitro).
For å utføre en polymerasekjedereaksjon kreves et sett med spesielle reagenser.
Testmaterialet introduseres i reagensrør med reagenser. Reagensrørene plasseres i et spesielt apparat - en PCR-forsterker, som er designet for å forsterke (øke antallet) av de ønskede RNA- eller DNA-fragmentene, PCR-forsterkeren fungerer i en syklisk modus. I en hvilken som helst syklus, hvis prøvene inneholder RNA- eller DNA-sekvensen til patogenet, akkumuleres flere og flere kopier av partiklene til disse nukleinsyrene i løsningen. Du kan bestemme tilstedeværelsen av patogenet og mengden av det i prøvene.
Typer PCR
Kvalitativ analyse av PCR lar deg få følgende resultat:
- negativ når patogenet av interesse ikke finnes i prøvene;
- positiv hvis det finnes sekvenser i prøvene som er karakteristiske for et bestemt patogen.
Med et positivt PCR-resultat kan vi snakke med 95 % nøyaktighet om tilstedeværelsen av en diagnostisert infeksjon. Samtidig når nøyaktigheten til PCR-sett som brukes til diagnostiske formål 100%.
Vanligvis bestemmes 5 % av feil resultater av den menneskelige faktoren. For eksempel kan brudd på teknikken for analyse og lagring av reagenser redusere nøyaktigheten av studien betydelig.
Kvantitativ PCR definerer begrepet viral belastning. Det er mulig å fastslå hvor mange sett med patogen-DNA som var i prøvene tatt fra pasienten.
Alvorlighetsgraden av infeksjonen er direkte proporsjonal med økningen i antallet. Du kan også fastslå suksessen til behandlingen for å redusere virusmengden.
Innsending for PCR-biomaterial
Kvantitativ PCR utføres i klinikken, hovedsakelig om morgenen. Ved et besøk til legen vil pasienten få beskjed om hva som må tas: skraping, utstryk, urin eller blod. PCR kan oppdage patogener uavhengig av forurensningsnivået til materialet.
For en positiv analyse kreves i teorien tilstedeværelsen av bare ett patogen i prøvene. I praksis prøver de å skape enda gunstigere forhold. Det er noen anbefalinger for dette:
- hvis de tar en skraping eller vattpinne fra kjønnsorganeneorganer, må du avstå fra intimt samleie tre dager før studien;
- du kan ikke vaske med antibakterielle medisiner eller vaske deg før analysen;
- tre timer før du tar et utstryk fra urinrøret, må du være tålmodig og ikke tømme tarmene.
Ikke følg disse reglene når du donerer blod.
Hvordan tolkes resultatene av kvantitativ PCR-analyse?
Kvantitativ evaluering av oppnådde resultater
I en rekke kliniske situasjoner dukker problemet med effektiviteten av behandlingen og/eller dynamikken i patologiprosessen opp. Slike spørsmål er spesielt relevante når man undersøker personer med kroniske infeksjoner (humant immunsviktvirus, hepatitt B og C). Ved diagnostisering er de basert på at akkumuleringen av amplikoner (PCR-produkter) er proporsjonal med tilstedeværelsen av kopier av ønsket gen i den analyserte prøven.
Selvfølgelig, å ta hensyn til resultatene av kvantitativ PCR gjøres ved gelelektroforese med studie av intensiteten til spesielle PCR-signaler. En forutsetning for en korrekt kvantitativ vurdering av de oppnådde resultatene er også positive pålitelige kontrollprøver som inneholder et kjent antall kopier av det ønskede genet (for eksempel tusen kopier av hepatitt C-genet for én PCR-reaksjon). Flere seriefortynninger av den kvantitative kontrollen gjør det mulig å generere kalibreringskurver og brukes til å evaluere innholdet av kliniske genokopier i kliniske prøver.
I definisjonen av kvantitativ PCR har en nøkkelprestasjon vært etableringenfluorescerende DNA-prober som tilsettes reaksjonsblandingen samtidig med enkle primere og lar deg spore PCR-prosessen i tid, det vil si sanntids PCR.
TaqMan-metoden refererer til syntesen av fluorescerende DNA-prober som er spesifikke for den midtre delen av amplikonet og har to merker i endene. En av dem er en fluorescerende etikett, den andre er et quencher-molekyl for denne fluorescensen.
En spesiell enhet, som er en hybrid av et fluorimeter og en termoblokk-forsterker, gjør konstante målinger av fluorescens i hvert reagensrør (sanntids PCR-prinsipp). Etter 20-40 sykluser med PCR, vil individuelle kurver bli oppnådd for hver prøve. Antall kopier av det ønskede genet som finnes i testprøven kan beregnes fra kalibreringskurver med kontrollprøver.
Et viktig trekk ved implementering av PCR ved fluorescerende metode er også at det ikke er behov for å åpne rør med en PCR-blanding når man tar hensyn til resultatene. Dette reduserer muligheten for romkontaminering med forsterkningsprodukter, og det er ikke nødvendig å tildele spesielle arbeidsområder for elektroforese.
Hva viser en kvantitativ PCR-transkripsjon?
Hva blir oppdaget?
Gjennom en metode som kvantitativ PCR, finner man kvalitative endringer i gener: insersjoner, delesjoner og punktmutasjoner. Men med noen arvelige lidelser dukker de tilsvarende symptomene opp som svar på en endring i innholdet i visse gener.
TakkKvantitativ analyse gir et numerisk resultat, oftest i IE / ml. Dette betyr at det i én milliliter av testprøven ble funnet et visst antall kopier av RNA eller DNA til patogenet, målt i internasjonale enheter.
Avhengig av omfanget, blir alvorlighetsgraden av infeksjonen diagnostisert. Blod testes vanligvis for å bestemme virusmengden, ettersom virus beveger seg fritt i blodet under sykdom.
Funksjoner
Kvantitativ PCR i en blodprøve har to funksjoner.
- Analysen utføres i nærvær av primere eller deoksyribonukleosidtrifosfater, som er merket med en fluorescerende eller radioaktiv markør for nøyaktig å bestemme innholdet i det dannede PCR-produktet.
- I PCR-prosessen, avslutt reaksjonen tidlig før for mange PCR-produkter vises. Dette skyldes det faktum at på det siste stadiet av metning, når det er mange PCR-produkter, fungerer både enzymet selv og substratene som de begrensende leddene til denne reaksjonen. Slutten av neste PCR-syklus under slike forhold er ikke lenger preget av en dobling av antall PCR-produkter, ubetydelige kvantitative forskjeller mellom forskjellige prøver utjevnes, som er ganske klart definert i de tidlige stadiene etter å ha gått gjennom en rekke reaksjonssykluser.
Kostnad for PCR-diagnostikk
PCR-forskning har en kostnad, som avhenger av hva slags infeksjon som skal testes, av analysemetodikken og testmaterialet. For å bestemme en infeksjon, må du gi innenfra200-800 rubler. Et gebyr for å ta biomateriale legges også til - omtrent 400 rubler.
