Flowcytometri er en cytologisk forskningsmetode som brukes for dybdeanalyse av celler. Fordelen er at den lar deg studere hver celle individuelt. Denne typen analyse hjelper til med å evaluere flere parametere i hundrevis av celler i løpet av sekunder. Som et resultat regnes cytofluorimetri som en av de raskeste og mest nøyaktige analysemetodene som for tiden er tilgjengelige for forskere og klinikere.
Prinsipp
Prinsippet for flowcytometri er basert på måling av lysspredning og luminescens (fluorescens) av celler. Cellesuspensjonen føres som en strøm med høy hastighet gjennom cytometercellen, hvor den bestråles med laser. Der utføres også den såk alte hydrodynamiske fokuseringen. Mekanismen er at strømmen fra cellen med de studerte partiklene ved utløpet strømmer inn i den ytre strålen, som har høyere hastighet. Som et resultat blir partikler justert i en ordnet kjede.
Forceller er merket med spesielle fluorescerende fargestoffer (fluorokromer). Takket være dem, laserstrålenfremkaller en sekundær glød. De mottatte lyssignalene registreres av detektorer. Deretter behandles informasjonen ved hjelp av programvarealgoritmer som lar deg telle individuelle cellepopulasjoner som er forskjellige i enkelte kriterier.
Forskning med konvensjonell mikroskopi klarer ofte ikke å skille mellom ulike celler fordi de ser like ut. Cytofluorimetri kan gi andre data (DNA-strukturintegritet), analysere proteinuttrykk, celleoverlevelse.
Siden eksitering av fluorokromer krever lysstråler med ulike bølgelengder, samt ulike typer detektorer, er moderne installasjoner utstyrt med flere deteksjonskanaler (fra 4 til 30). Antallet laseremittere kan være fra 1 til 7. Mer komplekse enheter tillater multiparameterstudier av flere egenskaper til partikler samtidig.
Fordeler og ulemper
Fordelene med flowcytometri inkluderer:
- høy behandlingshastighet (registrering av opptil 30 tusen hendelser på 1 sekund);
- mulighet for å studere et stort antall celler (opptil 100 millioner i en prøve);
- Kvantifisere intensiteten til fluorescerende lys;
- analyse av hver celle;
- samtidig studie av heterogene prosesser;
- automatisk separering av data etter cellepopulasjoner;
- kvalitetsvisualisering av resultater.
En annen funksjon ved denne teknologien er detden analyserte partikkelen kan farges med flere fluorescerende løsninger. Takket være dette skjer en multiparameterstudie.
Ulempene inkluderer kompleksiteten til det tekniske utstyret og behovet for spesiell prøveforberedelse.
Cytometre
De første enhetene av denne typen dukket opp allerede i 1968 i Tyskland, men de ble utbredt mye senere. For øyeblikket kan alle enheter som fungerer etter metoden for flowcytometri deles inn i 2 typer:
- enheter som måler fluorescerende stråling (to eller flere bølgelengder), 10° og 90° lysspredning (lavvinkel- og sidespredningsdetektor);
- enheter som, i tillegg til å måle flere mobilparametere, automatisk sorterer i grupper i henhold til disse kriteriene.
Foroverspredningsdetektoren er designet for å bestemme størrelsen på cellen, og sidespredningsanordningen lar deg få informasjon om tilstedeværelsen av intracellulære granuler, volumforholdet mellom cytoplasma og kjernen.
Klassiske cytometre, i motsetning til lysmikroskoper, tillater ikke å få et bilde av en celle. De siste årene har det imidlertid blitt utviklet kombinerte enheter som er i stand til å kombinere egenskapene til et mikroskop og et cytofluorimeter. De vil bli diskutert nedenfor.
Imaging cytometre
For instrumenter som brukes i klassisk flowcytometri,en funksjon er karakteristisk: hvis sjeldne hendelser er registrert i populasjonen av analyserte celler, er det ingen måte å vurdere hva deres essens er. Disse partiklene kan enten være restene av døde celler eller en sjelden gruppe av dem. I konvensjonelle enheter er slike data ekskludert fra den generelle strømmen av hendelser, men det er de som kan være av spesiell verdi for vitenskapelig og klinisk analyse.
Den nye generasjonen av bildedannende flowcytometre lar deg fange et bilde av hver celle som passerer i strømmen gjennom detektorsonen. Det er enkelt å se det ved å klikke på det tilsvarende området i diagrammet, som vises på dataskjermen.
Bruksområder
Flowcytometri er en universell metode som brukes innen mange felt innen medisin og vitenskap:
- immunologi;
- onkologi;
- transplantologi (transplantasjon av rød benmarg, stamceller);
- hematology;
- toxicology;
- biokjemi (måling av surhet inne i cellen, studiet av andre parametere);
- farmakologi (oppretter nye legemidler);
- mikrobiologi;
- parasitologi og virologi;
- oceanology (studiet av planteplankton for å vurdere tilstanden til vannforekomster og andre oppgaver);
- nanoteknologi og mikropartikkelanalyse.
Immunologi
Det menneskelige immunforsvaret består av et bredt utvalg av celler. Flowcytometri i immunologi gjør det mulig å evaluere deres struktur og funksjoner, det vil si å utføre morfofunksjonelleanalyse.
Slik forskning bidrar til å forstå immunitetens komplekse natur. Cellefenotyper endres som et resultat av aktivering av antigener, utvikling av patologier og andre faktorer. Cytofluorometri kan skille subpopulasjoner av immunceller i en kompleks blanding og evaluere alle endringene deres over tid.
Onkologi
En av de viktigste oppgavene innen onkologi er differensiering av celler etter deres type. Prinsippet for analyse ved flowcytometri i onkohematologi er basert på følgende fenomen: når en prøve behandles med et spesielt fluorescerende fargestoff, binder den seg til cytoplasmatiske proteiner. Etter deling i aktivt prolifererende celler, reduseres innholdet med det halve. Følgelig avtar intensiteten til celleluminescens to ganger.
Det finnes andre måter å oppdage prolifererende celler på:
- bruk av DNA-bindende fargestoffer (propidiumjodid);
- bruk av merket uracil;
- registrering av økt ekspresjonsnivå av cyklinproteiner, som er involvert i reguleringen av cellesyklusen.
