Rekombinant DNA er molekyler dannet ved laboratoriegenetiske rekombinasjonsteknikker for å kombinere genetisk materiale fra flere kilder. Det er mulig fordi DNA-molekylene til alle organismer har samme kjemiske struktur og bare er forskjellige i nukleotidsekvensen i den.
Creation
Molekylær kloning er en laboratorieprosess som brukes til å lage rekombinant DNA. Det er en av de to mest brukte metodene, sammen med polymerasekjedereaksjonen (PCR). Den lar deg kontrollere replikasjonen av en bestemt DNA-sekvens valgt av eksperimentatoren.
Det er to grunnleggende forskjeller mellom rekombinante DNA-metoder. Den ene er at molekylær kloning involverer replikasjon i en levende celle, mens PCR involverer in vitro. En annen forskjell er at den første metoden tillater klipping og liming av DNA-sekvenser, mens den andre forbedres ved å kopiere den eksisterende rekkefølgen.
Vector DNA
Å få rekombinant DNA krever en kloningsvektor. Det er avledet fra plasmider eller virus og er et relativt lite segment. Valget av vektor for molekylær kloning avhenger av valg av vertsorganisme, størrelsen på DNA som skal klones, og om fremmede molekyler skal uttrykkes. Segmenter kan kombineres ved hjelp av ulike metoder som restriksjonsenzym/ligasekloning eller Gibson-montering.
kloning
I standardprotokoller involverer kloning syv trinn.
- Velg vertsorganisme og kloningsvektor.
- Få en DNA-vektor.
- Danning av klonet DNA.
- Skaping av rekombinant DNA.
- Introduserer det i vertsorganismen.
- Utvalg av organismer som inneholder det.
- Utvalg av kloner med ønskede DNA-innsettinger og biologiske egenskaper.
Etter transplantasjon inn i vertsorganismen kan de fremmede molekylene som finnes i den rekombinante konstruksjonen komme til uttrykk eller ikke. Ekspresjon krever restrukturering av genet for å inkludere sekvenser som er nødvendige for DNA-produksjon. Den brukes av vertens oversettelsesmaskin.
Slik fungerer det
Rekombinant DNA fungerer når vertscellen uttrykker et protein fra rekombinante gener. Uttrykk avhenger av å omgi genet med et sett med signaler som gir instruksjoner for transkripsjonen. De inkluderer promoter, ribosombinding og terminator.
Problemer oppstår hvis genetinneholder introner eller signaler som fungerer som terminatorer for den bakterielle verten. Dette fører til for tidlig oppsigelse. Det rekombinante proteinet kan være feil bearbeidet, foldet eller degradert. Produksjonen i eukaryote systemer skjer vanligvis i gjær og trådformede sopp. Bruken av dyrebur er vanskelig på grunn av behovet for en sterk støtteflate for mange.
Properties of organisms
Organismer som inneholder rekombinante DNA-molekyler har tilsynelatende normale fenotyper. Deres utseende, oppførsel og metabolisme endres vanligvis ikke. Den eneste måten å demonstrere tilstedeværelsen av rekombinante sekvenser på er å undersøke selve DNAet ved å bruke polymerasekjedereaksjonstesten.
I noen tilfeller kan rekombinant DNA ha skadelige effekter. Dette kan skje når fragmentet som inneholder en aktiv promoter er lokalisert ved siden av et tidligere stille vertscellegen.
Bruk
Rekombinant DNA-teknologi er mye brukt innen bioteknologi, medisin og forskning. Dens proteiner og andre produkter finnes i nesten alle vestlige apotek, veterinærklinikker, legekontorer, medisinske eller biologiske laboratorier.
Den vanligste anvendelsen er innen grunnforskning, hvor teknologi er essensielt for mye av dagens arbeid innen biologiske og biomedisinske vitenskaper. Rekombinant DNA brukes til å identifisere, kartlegge og sekvensere gener, og bestemme demfunksjoner. rDNA-prober brukes til å analysere genuttrykk i enkeltceller og i vev fra hele organismer. Rekombinante proteiner brukes som reagenser i laboratorieeksperimenter. Noen spesifikke eksempler er gitt nedenfor.
Rekombinant chymosin
Kymosin er funnet i abdomasum og er et enzym som trengs for å lage ost. Det var det første genmodifiserte mattilsetningsstoffet som ble brukt i industrien. Et mikrobiologisk produsert rekombinant enzym strukturelt identisk med et kalve-avledet enzym er billigere og produseres i større mengder.
Rekombinant humant insulin
Erstattet praktisk t alt insulin fra animalske kilder (f.eks. griser og storfe) for behandling av insulinavhengig diabetes. Rekombinant insulin syntetiseres ved å introdusere det humane insulingenet i bakterier av slekten Eterichia eller gjær.
Veksthormon
Foreskrevet for pasienter hvis hypofyse ikke produserer nok veksthormon til å støtte normal utvikling. Før rekombinant veksthormon ble tilgjengelig, ble det hentet fra hypofysen til kadavere. Denne utrygge praksisen har ført til at noen pasienter har utviklet Creutzfeldt-Jakobs sykdom.
Rekombinant koagulasjonsfaktor
Dette er et blodkoagulerende protein som gis til pasienter med former for hemofili med blødningsforstyrrelser. De klarer ikke å produserefaktor VIII i tilstrekkelige mengder. Før utviklingen av rekombinant faktor VIII ble proteinet laget ved å behandle store mengder humant blod fra flere givere. Dette medførte en svært høy risiko for overføring av smittsomme sykdommer.
Diagnose av HIV-infeksjon
Hver av de tre mye brukte metodene for å diagnostisere HIV-infeksjon ble utviklet ved bruk av rekombinant DNA. En antistofftest bruker proteinet hennes. Den oppdager tilstedeværelsen av HIV genetisk materiale ved å bruke revers transkripsjonspolymerasekjedereaksjon. Utviklingen av testen ble muliggjort av molekylær kloning og sekvensering av HIV-genomene.
