Kromatografi er en av metodene for å separere stoffer. Den brukes til påfølgende kvalitativ og kvantitativ analyse av de fysiske og kjemiske egenskapene til mikropartikler. En variant av denne teknologien er affinitetskromatografi. Ideen om å differensiere proteinforbindelser ved å bruke egenskapen til molekylær affinitet har vært kjent i vitenskapen i flere tiår. Imidlertid har den fått sin utvikling først de siste årene, etter introduksjonen av svært porøse hydrofile materialer brukt som en matrise. Denne metoden gjør det mulig å løse både analytiske problemer (separasjon av stoffer og deres identifikasjon) og preparative problemer (rensing, konsentrasjon).
Essence
Affinitetskromatografi (fra det latinske ordet affinis - "tilstøtende", "relatert") er basert på affinitetsinteraksjoner, som er dannelsen av svært spesifikke bindinger mellom et spacer-molekyl (ligand eller affinant) og et målmolekyl. Disse mekanismene er utbredt i naturen (forbindelse av mediatorer eller hormoner og reseptorer, antistoffer ogantigener, hybridisering av polynukleotider og andre typer prosesser). I medisin har affinitetskromatografi blitt brukt til praktiske formål siden 1951
Komponentene er separert som følger:
- arbeidsløsning som inneholder stoffet som skal isoleres, føres gjennom sorbenten;
- ligand avsatt på sorbentmatrisen beholder denne substansen;
- det er konsentrert (akkumulering);
- ekstraksjon av det isolerte stoffet fra sorbenten ved å vaske med et løsemiddel.
Denne metoden lar deg isolere hele celler. Forskjellen fra tradisjonell sorpsjonskromatografi er at det er en sterk biospesifikk binding av den isolerte komponenten til sorbenten, som er preget av høy selektivitet.
Adsorbenter
Følgende stoffer brukes som adsorbenter:
- Gelforbindelser basert på agarose, et polysakkarid hentet fra agar. De mest brukte er 3 varianter: Sepharose 4B, CL (tverrbundet agarose) og affi-gel. Sistnevnte sammensetning er en modifisert gel av agarose og polyakrylamid. Den har større biologisk treghet, høy kjemisk og termisk motstand.
- Silica (silikagel).
- Glass.
- Organiske polymerer.
For å eliminere mekaniske hindringer under ligandkontakt, brukes ytterligere stoffer for å skille den fra bæreren (peptider, diaminer, polyaminer, oligosakkarider).
Utstyr
Affinitetskromatografiutstyr inkluderer følgende hovedenheter:
- lagertanker for den mobile fasen (eluent);
- høytrykkspumper for middels forsyning (oftest frem- og tilbakegående);
- filter for rengjøring av eluenter fra støv;
- doseringsenhet;
- kromatografisk kolonne for blandingsseparering;
- detektor for å oppdage separerte komponenter som forlater kolonnen;
- kromatogramopptakere og mikroprosessorenhet (datamaskin).
For å redusere mengden oppløst luft, føres helium først gjennom den mobile fasen. For å endre konsentrasjonen av eluenten er flere pumper som styres av programmereren installert. Kromatografiske søyler er laget av rustfritt stål (for økte krav til korrosjonsbestandighet), glass (universelt alternativ) eller akryl. For forberedende formål kan diameteren variere fra 2 til 70 cm. Ved analytisk kromatografi brukes mikrokolonner Ø10-150 µm.
For å øke følsomheten til detektorene, introduseres reagenser i blandingen, som bidrar til dannelsen av stoffer som absorberer flere stråler i det ultrafiolette eller synlige området av spekteret.
Metode
Det er 2 hovedtyper av væskeaffinitetskromatografi:
- Søyle, der kolonnen er fylt med en stasjonær fase og en blanding føres gjennom den med en strømningelueringsmiddel. Separasjon kan skje under trykk eller under tyngdekraften.
- Tynt lag. Eluenten beveger seg langs det flate adsorberende laget under påvirkning av kapillærkrefter. Adsorbenten påføres en glassplate, keramikk- eller kvartsstav, metallfolie.
Hovedstadier av arbeidet inkluderer:
- forberedelse av adsorbenten, fiksering av liganden på bæreren;
- mating av separasjonsblandingen til den kromatografiske kolonnen;
- mobilfaselasting, komponentbinding med ligand;
- faseerstatning for å isolere det bundne stoffet.
Destination
Affinitetskromatografi brukes til å isolere følgende typer stoffer (typen ligand som brukes er angitt i parentes):
- analoger av enzymatiske hemmere, substrater og kofaktorer (enzymer);
- bioorganiske stoffer med tegn på genetisk fremmedhet, virus og celler (antistoffer);
- karbohydrater med høy molekylvekt, monosakkaridpolymerer, glykoproteiner (lektiner);
- nukleære proteiner, nukleotidyltransferaser (nukleinsyrer);
- reseptorer, transportproteiner (vitaminer, hormoner);
- proteiner som interagerer med cellemembraner (celler).
Denne teknologien brukes også for å oppnå immobiliserte enzymer, og binding av dem til cellulose muliggjør produksjon av immunosorbenter.
kromatografi av DNA-bindende proteiner
Isolering av DNA-bindende proteiner utføres vhaheparin. Denne glykosaminoglykanen er i stand til å binde et bredt spekter av molekyler. Affinitetskromatografi av proteiner fra denne gruppen brukes til å isolere stoffer som:
- faktorer for initiering og forlengelse av translasjon (syntese av nukleinsyremolekyler og proteiner);
- restrictases (enzymer som gjenkjenner visse sekvenser i dobbelttrådet DNA);
- DNA-ligaser og polymeraser (enzymer som katalyserer sammenføyningen av to molekyler for å danne en ny kjemisk binding og er involvert i DNA-replikasjon);
- serinproteasehemmere som spiller en viktig rolle i immun- og inflammatoriske prosesser;
- vekstfaktorer: fibroblast, Schwann, endotelial;
- proteiner av ekstracellulær matrise;
- hormonreseptorer;
- lipoproteiner.
Dignity
Denne metoden er en av de mest spesifikke for isolering av reaktive forbindelser (enzymer og større aggregater - virus). Den brukes imidlertid ikke bare for å isolere biologisk aktive stoffer.
Deteksjon av antistoffer i små mengder, kvantitativ vurdering av polyadenylsyre, rask bestemmelse av molekylmassene til dehydrogenaser, fjerning av visse forurensninger, studie av kinetikken for aktivering av den inaktive formen av trypsin, molekylstrukturen til mennesker interferoner - dette er ikke hele listen over studier der affinitet brukes i. kromatografi. Bruken i klinikken skyldes dens fordeler som:
- Effektiv rengjøringsevneproteiner, polysakkarider, nukleinsyrer. De er litt forskjellige i sine fysiske og kjemiske egenskaper og mister aktivitet under hydrolyse, denaturering og andre typer behandling som brukes i andre metoder.
- Hastigheten for separering av stoffer, prosessens dynamiske natur.
- Ingen behov for spesiell enzymrensing og isoenzymhomogenisering for å bestemme dissosiasjonskonstanter.
- Kunne separere et bredt spekter av stoffer.
- Lavt forbruk av ligander.
- Mulighet for separering av stoffer i store volumer.
- Reversibel prosess for binding av biologiske makromolekyler.
Denne teknikken kan kombineres med andre for å pålegge et ekstra felt (gravitasjonsfelt, elektromagnetisk). Dette lar deg utvide de tekniske egenskapene til kromatografi.
Enzymatisk engineering
Takket være denne metoden begynte den aktive utviklingen av en ny gren innen bioteknologi - enzymteknikk.
Affinitetskromatografi for enzymisolering har følgende fordeler:
- å få enzymer i store mengder som et resultat av mindre tid, som et resultat - deres reduksjon i pris;
- immobilisering av enzymer kan utvide omfanget av deres anvendelse i medisin og industri betydelig;
- Associeringen av enzymer med en uløselig fast bærer gjør det mulig å studere påvirkningen av mikromiljøet og retningen av reaksjoner, som spiller en viktig rolle i naturlige og fysiologiske prosesser.
